1. Zamreženje in izolacija celičnih peletov
V vsako posodo, ki vsebuje gojišče celične kulture, dodajte dovolj 16 % formaldehida, da dobite končno koncentracijo 1 % formaldehida.
Nežno pretresite, da se premeša. Inkubirajte pri sobni temperaturi 10 minut v kemični dimni komori.
V vsako posodo, ki vsebuje gojišče celične kulture in formaldehid, dodajte raztopino glicina (10X) do končne koncentracije 1X. Nežno pretresite, da se premeša. Inkubirajte pri sobni temperaturi v kemični dimni komori 5 minut.
V dimni napi aspirirajte medij, ki vsebuje formaldehid/glicin. Odpadke, ki vsebujejo formaldehid, pravilno zavrzite.
Celice dvakrat sperite z enim volumnom kulture predhodno ohlajenega PBS in vsakič odstranite z aspiracijo.
Celicam dodajte 1 ml predhodno ohlajenega PBS in celice odstranite s strganjem. S pipeto prenesite celično suspenzijo v 1,5 ml epruveto za mikrocentrifugo. Centrifugirajte pri 3000 × g 5 minut.
Odstranite PBS. Shranjujte celični pelet pri -80 stopinjah ali nadaljujte neposredno z naslednjim razdelkom: Liza in prebava z MNazo.
2. Liza in razgradnja MNaze
Uporabite zgoraj pripravljene zamrežene celice. Če so celice zamrznjene, jih je mogoče odtajati na ledu.
Dodajte 200 μL pufra za ekstrakcijo membrane, ki vsebuje zaviralce proteaze/fosfataze, celični peleti in pipetirajte gor in dol, da razstavite peleto. Epruveto vrtinčimo 15 sekund in inkubiramo na ledu 10 minut.
Centrifugirajte pri 9000 × g 3 minute in odstranite supernatant.
Resuspendirajte jedra v 200 μL delovne raztopine pufra za prebavo MNase.
Dodajte 0,5 μL razredčene MNase (stopnja ChIP) (10 U/μL) v 4,5 μL pufra za prebavo MNase. Pipetirajte gor in dol, da se dobro premeša
Dodajte 2 μL razredčene MNase, epruveto premešajte in inkubirajte v vodni kopeli pri 37 stopinjah 15 minut, pri čemer obrnite vsakih 5 minut.
Dodajte 20 μl raztopine MNase za zaustavitev reakcije, na kratko premešajte in inkubirajte na ledu 5 minut.
Centrifugirajte pri 9000 × g 5 minut, da dobite jedra. Odstranite supernatant.
Resuspendirajte jedra v 100 μl pufra za redčenje 1X IP, ki vsebuje zaviralce proteaze/fosfataze.
Prekinite jedrsko membrano z ultrazvočno obdelavo z nekaj impulzi na ledu. Opomba: Optimalne pogoje za popolno lizo je mogoče opazovati pod svetlobnim mikroskopom.
Centrifugirajte pri 9000 × g 5 minut in prenesite supernatant, ki vsebuje prebavljeni kromatin, v novo 1,5 ml epruveto. Nadaljujte z imunoprecipitacijo ali shranite vzorce pri -80 stopinjah.
III. Imunoprecipitacija
1. Prenesite 10 μL supernatanta, ki vsebuje prebavljeni kromatin, v 1,5 ml epruveto in shranite pri -20 stopinjah. To je 10 % celotnega vhodnega vzorca iz enega vzorca.
2. Prenesite preostalih 90 μL supernatanta v 410 μL pufra za redčenje 1X IP
3. Dodajte primarno protitelo
4. Zmešajte in inkubirajte IP reakcijo pri 4 stopinjah 2 uri do čez noč. Opomba: Za beljakovine z nizko vsebnostjo bo inkubacija čez noč močno povečala signal.
5. Zavrtite cev z magnetnimi kroglicami proteina A/G razreda ChIP, da dobite enotno suspenzijo. Vsakemu IP dodajte 20 μL magnetnih kroglic in premešajte ter inkubirajte pri 4 stopinjah 2 uri.
6. Po inkubaciji zberite kroglice z magnetnim stojalom ter previdno odstranite in zavrzite supernatant.
7. Dodajte 1 mL pufra za izpiranje IP 1, na kratko premešajte, premešajte in inkubirajte 5 minut.
8. Zberite kroglice z magnetnim stojalom ter previdno odstranite in zavrzite supernatant.
9. Trikrat izvedite koraka 7 in 8 z IP Wash Buffer 1.
10. Enkrat izvedite koraka 7 in 8 z IP Wash Buffer 2.
IV. IP elucija
Spranim kroglicam dodajte 150 μL 1X IP elucijskega pufra, tesno zaprite in inkubirajte pri 65 stopinjah z močnim stresanjem 30 minut. Če termomešalnik ni na voljo, postavite kolono v grelni blok pri 65 stopinjah in inkubirajte 40 minut. Epruveto zavrtite vsakih 10 minut, da ponovno suspendirate kroglice.
Med korakom elucije pripravite 1,5 ml mikrocentrifugirno epruveto, ki vsebuje 6 μL 5 M NaCl in 2 μL 20 mg/mL proteinaze K za vsak IP.
Odtalite 10 % vnosa in dodajte 150 μL 1X IP elucijskega pufra, 6 μL 5 M NaCl in 2 μL 20 mg/mL proteinaze K. Epruveto postavite na sobno temperaturo do naslednjega koraka.
Po inkubaciji pri 65 stopinjah odstranite epruveto iz grelnega bloka in zberite kroglice z magnetnim stojalom.
Odstranite supernatant (ki vsebuje eluirane komplekse protein-kromatin) in dodajte NaCl in proteinazo K v pripravljeno epruveto. Zaprite 1,5 ml epruveto za centrifugo, vrtinčite vse IP in vhodne vzorce ter postavite v 65-stopinjski toplotni blok za 1,5 ure.
V. Čiščenje DNK
Vsakemu eluiranemu IP in vhodnemu vzorcu dodajte 750 μL pufra za vezavo DNA.
Dodajte 500 μL vsakega vzorca v kolono za čiščenje DNA in vstavite v 2 ml zbirno epruveto. Kolono centrifugirajte pri 10,000 × g 1 minuto in tekočino zavrzite.
Dodajte preostali vzorec v isto kolono za čiščenje DNK. Kolono centrifugirajte pri 10,000 × g 1 minuto in tekočino zavrzite.
Postavite kolono nazaj v zbirno epruveto in dodajte 750 μL pufra za izpiranje kolone DNA. Kolono centrifugirajte pri 10,000 × g 1 minuto in tekočino zavrzite.
Kolono postavite nazaj v prazno zbiralno epruveto in centrifugirajte pri 10,000 × g 2 minuti.
Postavite kolono v novo 1,5 ml centrifugalno epruveto in dodajte 50 μL elucije kolone DNA neposredno na sredino vsake kolone.
Centrifugirajte pri 10,000 × g 1 minuto in zavrzite kolono. Nastala raztopina je prečiščena DNK. Nadaljujte z odkrivanjem seq ali qPCR.